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摘要

养殖密度的增加增加了低氧发生的可能性，这必然会导致鱼类的低氧应激。本研究模拟养殖过程中可能出现的低氧环境(1.2±0.2mg/L)，利用高通量测序技术对miRNA-mRNA进行了整合分析，以揭示miRNAs在急性低氧暴露下对大口黑鲈肝脏代谢的调节作用。根据差异表达的mRNA和miRNAs靶基因的差异表达所涉及的途径，我们发现了7个与糖和脂代谢有关的过程，即丙酮酸代谢、胰岛素信号通路、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、糖酵解/糖异生、PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)信号通路和VEGF(血管内皮生长因子)信号通路。这7个过程分别与糖代谢、胰岛素信号通路、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成、糖酵解/糖异生、PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)信号通路和VEGF(血管内皮细胞生长因子)信号通路有关。与糖脂代谢相关的miRNAs有13个，包括miR-a-3p、miR--5p、miR-15b-5p、miR-96-5p、miR-27a-3p、miR--3p、miR--3p、miR-b-3p、miR--3p、miR-a-3p、miR--3p、miR-b。它们的目的基因分别为acsl4、aldh3a、irs、ehhadh、ad、mkik1、pik3cb、minnp1、cyp7a1、hk1、pgm和crk。具体地说，miRNAs在调节鱼类在低氧条件下的糖酵解和脂质动员方面发挥着重要作用。根据我们目前和以前的研究结果，我们可以推测miRNAs在低氧条件下代谢模式的转换中起着重要的调节作用，这种调节作用可能是保守的。这些结果将有助于理解鱼类的缺氧反应机制。

前言

水环境中的缺氧可对鱼类产生许多不利影响，甚至可能导致养殖鱼大量死亡(曾等人，年；Mahfouz等人，年；Robertson等人，年；朱等人，年)。当溶解氧(DO)浓度降到2.0mg/L以下时，就被认为是缺氧(Diaz，1)。在水产养殖业通常使用的浅水池中，由于养殖规模和密度的增加，溶解氧的快速和剧烈变化已经变得非常普遍，这可能在水产养殖业的发展中造成严重的生产和经济损失(Mahfouz等人，年；Diaz和Breitberg，年)。大量营养物质进入水产养殖环境，导致浮游植物数量大幅增加，水环境中的DO水平显著下降，导致缺氧，特别是在光合作用停止的夜间(Diaz和Breitberg，)。一般来说，溶解氧含量还受风速、温度、一天中的时间和季节的影响(Levin和Breitburg，；耿氏等人，)。

因此，水环境中的溶解氧经历了广泛的时空变化(朱等人，年)。各种复杂的生理过程参与了低氧反应(Terova等人，8；Rahman和Thomas，7)。在低氧条件下，由于氧气供应不足，鱼类无法产生足够的能量来满足它们的需要，这不可避免地将代谢模式从有氧代谢转变为无氧代谢，以弥补能量供应的不足(Polymeropoulos等人，年；Glencross，9年)。在这个过程中，葡萄糖首先转化为丙酮酸，最后产生乳酸。(Cuninghame等人，年；Mandic等人，年；理查兹，)。缺氧也可以促进脂肪分解，但它会抑制组织吸收非酯化脂肪酸(NEFA)的能力(尹某等人，9年)。研究人员对低氧条件下的生理变化进行了广泛的研究(Nikinmaa和Rees，5)。例如，低氧条件会改变代谢相关酶的活性及其基因表达，这是由特定基因的差异转录引起的。(Li等人，年；Cooper等人，2年)。

随着测序技术和生物信息学的发展，通过下一代测序技术(NGST)探索鱼类环境适应机制已成为重要手段，RNA测序(RNA-Seq)技术可以在整个转录组水平上进行(Wolf，)。RNA-Seq已成为在整个转录组水平上分析无参考基因组物种基因表达谱的有效方法(Zhang等人，a；Nguyen等人，)。近年来，利用RNAseq技术研究了鱼类在低氧胁迫下的转录组反应，发现低氧可以显著影响斑马鱼和大西洋鲑鱼肝脏的基因表达谱(Yong等人，年；Olsvik等人，年)。通过RNA-Seq和生化分析发现，低氧胁迫的强度和持续时间决定了大口鲈鱼能量代谢的变化程度。具体地说，严重缺氧对能量代谢的影响更大，反应时间更短(Sun等人，年)。此外，microRNA(MiRNA)是一种非编码RNA，是调控基因表达的关键因子，它可以与靶基因结合改变靶基因的表达(Bizuayehu和Babiak，)。然而，miRNAs对环境变化敏感，因此它们的差异表达对于生物体适应环境非常重要(Kim等人，年)。许多证据表明，缺氧可以显著影响代谢(Mahfouz等人，)，然而，其代谢调控机制仍不清楚，尤其是涉及糖脂代谢的反应以及参与转录调控的相关因素仍然知之甚少。

年，大口鲈鱼(MicropterusSalmoides)被引入中国大陆(Baietal.，8)。随着消费需求的增加，其养殖规模不断扩大。这会导致水质恶化，增加缺氧条件的可能性，从而不可避免地给鱼类造成缺氧压力。因此，我们在实验室条件下建立了养殖过程中可能发生的低氧环境，并通过miRNA-mRNA的综合分析，揭示了在急性重度低氧胁迫下，miRNAs在大口鲈鱼肝脏代谢中的调控作用。

结果

1

参考转录组的组装和注释

我们之前的一项研究描述了大口鲈鱼肝脏的mRNA图谱(Sun等人，年)。通过RNA测序和数据分析，共获得,个序列。其中，24,个转录本被注释为几个功能，包括细胞过程和信号，代谢，信息存储和处理。此外，14,个转录本被注释为个不同的功能通路(补充1)。

2

DEGS在低氧状态下的功能分析

共有个Uniges在SHG中有显著差异表达(图1和补充2)。在我们的结果中，我们发现个单基因在CG中的不同时间表现出显著的差异，并将它们排除在差异分析的结果之外，以减少假阳性。排除这些因素后，我们确认了个在SHG中唯一的Uniges为degs(图2)。对这个单基因进行随后的注释分析(图3)。S1)。许多基因被归类为与代谢调节相关的类别，如代谢和大分子代谢过程的正调节(GO：和GO：)。KEGG途径分析结果表明，低氧响应的主要代谢途径包括PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)信号通路、糖酵解/糖异生作用、脂肪酸生物合成、丙酮酸代谢、脂肪酸降解和血管内皮细胞生长因子(VEGF)信号通路等(GO和KEGG的详细信息见补充3)。(见图3)

图1.不同组和时间点库之间的DEG

(A)同一组转录产物在不同时间的差异表达分析得到的火山图。(B)同一时间下不同组别转录本的差异表达分析得到的火山图。P值的-log10用于Y轴，折叠更改的log2用于X轴。

图2。缺氧水平和应激时间对DEGS的影响。

(A)主要处理(常氧和严重缺氧)、主要周期(0h、4h、8h、12h和24h)在大口黑鱼肝脏中的停滞状态的维恩图。上述数据的维恩图，说明在不同文库的比较中，肝脏中两个部分(SHGdegs和CGdegs)的重叠。红色方框被标记为受缺氧严重影响的DEGS。(B)根据例受肝脏缺氧影响显著的RPKM值进行检测，图例显示为RowZ-Score。(若要解释本图例中对颜色的引用，请参阅本文的网络版)

图3.DEG的KEGG浓缩分析

(A)KEGGB级浓缩。(B)TOP50途径富集。(实际名称见补充_3)

3

MicroRNAs的测序和表达谱分析

测序从CG的15个小RNA文库(rawreads的98.07%)平均产生13,,次cleanreads，从SHG的15个小RNA文库平均产生12,,个rawreads(rawreads的97.92%)(表S1)。我们鉴定了个已知的miRNAs(补充4)。经过差异表达分析，我们发现个miRNAs在SHG(图4和补充_5)中有显著差异表达，个miRNAs在CG中的不同时间表现出显著差异，为了减少假阳性，我们将它们排除在差异分析结果之外。因此，我们确认了56个SHG特有的miRNAs作为DEG进行进一步分析(图5)。

图4.不同组和时间点文库之间的DEmiRNAs

(A)同一组miRNA在不同时间的差异表达分析得到的火山图。(B)同一时间不同组miRNAs差异表达分析得到的火山图。P值的-log10用于Y轴，折叠更改的log2用于X轴。

图5.低氧水平和应激时间对DEmiRNAs的影响.

(A)主要处理(常氧和严重缺氧)、主要时期(0h、4h、8h、12h和24h)的大口鲈鱼肝脏中的DemiRNAs失稳的Venn图。上述数据的维恩图，说明在不同文库的比较中，肝脏中两个部分(SHGdegs和CGdegs)的重叠。红色方框被标记为受缺氧严重影响的DEGS。(B)根据56个受到肝脏缺氧显著影响的DEmiRNAs的RPKM值进行检测，图例显示RowZ-Score。

4

MiRNAs靶基因的GO和KEGG分类分析

总共有个基因被鉴定为差异表达miRNAs的靶基因。GO分类分析结果表明，细胞(GO：)、细胞部分(GO：)、细胞内(GO：)、催化活性(GO：)、转移酶活性(GO：)、催化活性、对蛋白质的作用(GO：)、生物调节(GO：)、代谢过程(GO：0008)和有机物代谢过程(GO：)是主要的类别(图2)。S2和补充(6)。KEGG结果将个靶基因分类为条不同的通路(图6A，补充_6)。结果表明，胰岛素信号途径、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成等糖脂代谢途径显著丰富(P0.05)(图6B)。

图6.DEmiRNAs的KEGG富集分析。

(A)KEGGB级浓缩。(B)糖脂代谢相关途径的丰富。

5

路径整合分析

总之，通过比较差异表达的mRNA参与的途径和差异表达的miRNAs的靶基因参与的途径，我们发现它们表明在急性缺氧应激时，肝脏中的反应途径是相同的。我们重点研究了7条与碳水化合物和脂类代谢相关的途径（图7），即丙酮酸代谢、血管内皮生长因子信号通路、糖酵解/糖异生、胰岛素信号通路、PPAR信号通路、脂肪酸生物合成和脂肪酸降解。我们筛选了参与这些通路的12个mRNA和13个差异表达的miRNA(图8)，包括miR-a-3p、miR--5p、miR-15b-5p、miR-96-5p、miR-27a-3p、miR--3p、miR--3p、miR-b-3p、miR--3p、miR-a-3p。目的基因分别为acsl4、aldh3a、irs、ehhadh、pad、mkik1、pik3cb、minnp1、cyp7a1、hk1、pgm、crk。这些基因的详细信息见表S2。

图7。DGE和DEmiRNAs靶基因之间KEGG通路的Vennmap。

注：蓝色圆圈内描绘的是低氧胁迫下丰富差异表达mRNA的途径。红圈内描绘的是低氧胁迫下差异表达miRNAs靶基因的丰富途径。中段横截面显示共同通路丰富。

图8。葡萄糖和脂肪代谢的七条主要途径中miRNAs的预测目标基因。

注：糖脂代谢的7条主要途径包括丙酮酸代谢、胰岛素信号通路、脂肪酸降解、糖酵解/糖异生、PPAR信号通路、血管内皮生长因子信号通路、脂肪酸生物合成。红色圆圈代表靶基因，绿色实心钻石代表miRNA，虚线代表潜在的调控关系。

6

MiRNA和mRNA表达水平的验证

我们之前的研究证实了RNA-seq(包括mRNA-seq和miRNA-seq)的准确性(Sun等人，年)。基因表达分析结果表明，缺氧可显著影响糖脂代谢相关的miRNAs和mRNAs的表达。（图S3和图S4）。例如，miR-a-3p在SHG中的表达水平在0h和24h就开始升高(P0.01和P0.05)，但在4h~12h之间保持稳定，而miR-b-3p和miR-96-5p的表达在0h才开始上调，然后恢复到正常水平(P0.01)。MiR-a-3p在SHG中的表达在0h、4h和8h即开始升高(P0.01或P0.05)，12h后恢复到正常水平(P0.05)。MiR-15b-5p的表达在缺氧0h开始升高(P0.01)，4h和8h恢复到正常水平(P0.05)，12h表达下调(P0.05)。MiR-27A-3p、miR--3p和miR--3p的表达水平在应激后0h升高(P0.01)，4h下降(P0.01或P0.05)，8h后恢复正常(P0.05)。MiR-a-3p在SHG中的表达在早期稳定，仅在24h时表达升高(P0.01)。MiR--3p在SHG中的表达水平在4h时升高(P0.01)，在8h时下降(P0.01)。缺氧应激后，miR--5p和miR-B-3p在SHG中的表达水平呈波动上升趋势，缺氧应激后0h和8h，miR--5p和miR-B-3p的表达水平均显著升高(P0.01)。MiR-a-3p在SHG中的表达水平在低氧应激过程中也有波动，0h和24h下降(P0.01或P0.05)，4h和12h升高(P0.01)。

此外，在低氧胁迫的早期阶段，这些基因的大部分表达水平是稳定的。SHG中Crk和Bad的表达水平在8h和24h均明显升高(P0.01)。在伤后8h和12h，神经节中acsl4和cyp7a1的表达增加(P0.01)。在8h和24h，脑组织中aldh3a、PGM和ehhadh的表达水平均显著升高(P0.01)。HG中irs2和mKnk1的表达在8h、12h和24h均明显升高(P0.01)。低氧应激后0h，脑海马齿状回minpp1表达开始下降(P0.01)，4h恢复正常(P0.05)，8h后表达上调(P0.01)。Pik3cb在SHG中的表达波动较大，但在低氧应激后有所增加，在0h、8h和12h时增加(P0.01)。缺氧0h、8h、24h后，HK1在SHG中的表达也有波动，但在缺氧后0h、8h和24h，HK1的表达增加(P0.01)。

7

预测关键miRNAs的调控功能

基于mRNA和miRNA的表达数据，我们发现miRNA与靶基因之间存在显著的负相关(P0.05)，并预测了它们之间的调控关系。（图S5）。结果表明，acsl4、ehhadh、mkk1、pik3cb、cyp7a1、pgm和crk基因可能分别受到miR-a-3p、miR-96-5p、miR--3p、miR-a-3p、miR-b-3p、miR-B-3p和miR-b-3p的负调控。Irs2基因可能受miR--5p和miR-15b-5p的负调控。HK1基因可能是miR--3p和miR-a-3p的靶点。KEGG数据库被用来将这些整合到以相同基因为节点的葡萄糖和脂肪代谢途径中，以创建网络图(图9)。

图9.低氧应激期间miRNAs对肝脏葡萄糖代谢的潜在调节。注：灰色实心框表示miRNA，黑色实心框表示靶基因。黑色中空框架表示本文未检测到的基因和代谢物。红色箭头表示促进代谢过程的潜在作用，蓝色箭头表示负调控靶基因表达的潜在作用。

讨论

1

急性缺氧应激增强糖酵解和脂质动员过程

在本研究中，我们利用差异表达的miRNAs的差异表达基因和靶基因，研究了大口鲈鱼对急性低氧胁迫的反应所涉及的分子途径。比较差异表达的mRNA-seq和miRNA-seq的数据，我们发现在急性低氧应激过程中肝脏中有相同的途径(图7)，这些相同的途径主要集中在代谢过程，特别是与糖和脂代谢相关的过程，即丙酮酸代谢、胰岛素信号通路、脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、糖酵解/糖异生以及PPAR信号通路。这些结果表明，在低氧条件下，鱼类会改变其糖脂代谢以适应环境中溶解氧的变化，这一发现也与我们之前的研究(Sun等人，年)相呼应。低氧条件迫使鱼类进行厌氧代谢来提供能量(Polymeropoulos等人，年；Gracey等人，年；Richards，年)，但这种能量供应方法不能提供足够的能量。我们之前的研究发现，在低氧条件下，肝脏中葡萄糖和糖原含量降低，LD含量增加，肝脏总ATP含量显著降低(Sun等人，；Yang等人，年)。此外，糖酵解途径中关键酶PK、HK和PFK活性的增加是低氧胁迫下鱼类糖酵解途径增强的直接证据(Sun等人，；Yang等人，年)。许多研究表明，在低氧条件下，糖酵解，特别是厌氧糖酵解，可能是一种重要的能量代谢方法，使鱼类能够补偿能量匮乏(Lyssiotis和Kimmelman，)。本研究发现与葡萄糖代谢相关的两条关键途径，即丙酮酸代谢途径和糖酵解途径，并发现这两条途径中的关键基因(Crk、PGM、HK1、minpp1和aldh3a)在低氧胁迫4h后表达显著增加，表明丙酮酸代谢和糖酵解途径增强，无氧糖酵解成为主要的能量代谢途径(Genz等人，；Richards，)，这表明在低氧胁迫下，这两条途径中的Crk、PGM、HK1、minpp1和aldh3a的表达显著增加，表明丙酮酸代谢和糖酵解途径增强，无氧糖酵解成为主要的能量代谢途径(Genz等，；Richards，)。大多数研究表明，长期低氧应激时的能量需求主要由分解脂类来满足，而对急性低氧应激时脂代谢的研究较少(Li等，年)。然而，在mRNA-seq和miRNA-seq的分析中，我们都观察到与脂质代谢相关的通路增加，这有力地表明脂肪酸的生物合成、脂肪酸的降解以及PPAR信号通路在缺氧条件下起着重要的作用。低氧应激4h后，与脂质代谢相关的关键基因acsl4和ehhadh的表达显著增加。这表明脂质代谢途径在急性缺氧条件下也受到显著影响(Li等人，年；Preiser等人，年)。研究表明，由于环境压力，鱼类肝脏中脂肪酸结合蛋白的表达和肝细胞对脂肪的利用均增加(Kyprianou等人，年)。低氧暴露增加肝脏甘油三酯的动员(Mustafa等人，年；Gracey等人，年)。我们以前和现在的研究发现，肝脏脂质动员和激活增强，这可能促进甘油进入低氧应激早期阶段的糖酵解途径(Sun等人，年；Yang等人，年)。这将帮助鱼类应对可能的长期低氧应激，因为长期低氧应激下的主要能量来源是脂肪分解(Li等人，年)。

2

MiRNA在低氧应激分子反应中的作用

在先前的研究中，irs2通过上调缺氧条件下PIK3CA和MKNK1的表达来诱导HIF-1α的高表达(Sun等人，年)。然而，鱼类在低氧条件下对新陈代谢的转录调控知之甚少。使用RNA-Seq可以识别鱼类对环境压力的反应中涉及的关键分子(Zhang等人，年)。虽然在哺乳动物的黑素细胞生物学中已经发现了大量的miRNA(Mione和Bosserhoff，年)，但大多数在鱼类对低氧条件的反应中起作用的miRNAs还没有被研究(Bizuayehu等人，年；Bizuayehu和Babiak等人，年；Yanet等人，年)。分析miRNA表达谱已被证明是揭示未知功能调控方面的一种非常有效的方法(Ambros，4)。

结果表明，miR-b-3p、miR-b-3p、miR--3p、miR-a-3p、miR--5p、miR-15b-5p、miR-a-3p、miR--3p、miR-b-3p、miR-a-3p和miR-96-5p参与了低氧时糖脂代谢的调节。其他研究已经确认miR-b-3p、miR-B-3p、miR--3p和miR-15b-5p是许多癌症中与细胞增殖和移动性相关的调节因子(Li等人，；邓等人，；Santi等人，；肖等人，；Wu等人，)，并且miRNA--3p通过DNA甲基转移酶1介导的神经纤维瘤病类型的下调来促进胶质瘤细胞的侵袭(Li等人，年；邓等人，年；Santi等人，年；Wu等人，年)，并且miRNA--3p通过DNA甲基转移酶1介导的神经纤维瘤病类型的下调而促进胶质瘤细胞的侵袭。另一项研究表明miR-a-3p与炎症有关(Borrelli等人，年)。先前的研究也发现，miRNA-a-3p在低氧条件下4h的表达要高得多(Liu等人，a)，并与miR-抗病毒免疫反应有关(Eslamloo等人，年)。Mir--3p的过表达显著抑制了癌细胞的增殖和葡萄糖代谢(Liu等人，b)，并且miR-a-3p在调节肝脏胰岛素敏感性和脂肪肝中的重要性已经被揭示(肖等人，年)。然而，尽管有这些发现，它们在鱼类新陈代谢中的潜在功能仍不清楚。我们鉴定的miR-A-3p，已经被证明参与了葡萄糖耐受性鱼类肝脏的葡萄糖代谢(Zhang等人，b)。此外，miR-20a-5p、miR-15a-5p和miR-15b-3p(miR-15超家族)也被证明参与鱼肝脏的葡萄糖代谢(Kostyniuk等人，年)，这表明它们的下调可能会增加葡萄糖的利用(Zhang等人，年；Gao等人，年；Finnerty等人，年)。在本研究中，miR-15b-5p在低氧条件下显著降低，其靶基因irs2表达增强，提示急性低氧应激促进糖酵解过程。值得一提的是，在鱼类中，对miRNAs潜在功能的研究相对有限，例如，在哺乳动物中发现的成熟miRNAs比鱼类多十倍(Bizuayehu和Babiak，年)。

然而，根据几种鱼类和高等脊椎动物的miRNA序列比较结果，可以发现某些成熟的miRNA序列在脊椎动物中进化上保守(Mennigen等人，年；yi等人，年；Li等人，年)。因此，调节鱼类肝脏代谢的部分或全部miRNA在哺乳动物中可能是相同的(Doddapaneni等人，年)。如果谨慎使用，并在解释结果时小心，我们可能会利用之前从更大种类的动物群体中获得的研究结果，对鱼类miRNAs的潜在功能得出新的想法。总体而言，我们的结果表明miRNAs在鱼类的葡萄糖代谢中起着关键的调节作用。

值得指出的是，先前的研究表明，microRNA基因突变会干扰它们的功能，导致表型变异(Georges等人，7年)。MicroRNA基因内的多态性为动物育种中的表型特征提供了新的生物标记(Skok等人，年)。然而，由于大量的鱼类物种和不完整的基因组数据，人们对鱼类中microRNAs的遗传变异知之甚少。因此，本研究获得的数据将加深我们对miRNAs在调节鱼类糖脂代谢中的作用的理解，并为后续研究提供基础数据。

结论

为了快速适应急性缺氧条件，鱼类改变了葡萄糖和脂肪代谢途径的活性。MiRNAs参与了急性缺氧应激时糖脂代谢的调节。具体地说，miRNAs在调节鱼类在低氧条件下的糖酵解和脂质动员方面发挥着重要作用。本研究首次系统分析了miRNAs在低氧条件下对大口鲈鱼肝脏代谢的调节作用。根据我们目前和以前的研究结果，我们可以推测miRNAs在低氧条件下代谢模式的转变中起着重要的调节作用，这种调节作用可能是保守的。

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